用于可控表达的整合型I-CRISPR-cBEST碱基编辑器及其构建和应用
知识产权简介
本发明公开了一种可控整合型的I-CRISPR-cBEST（Integrative CRISPR-Cytosine Base Editor System）碱基编辑器及其构建和应用。本发明以含 φC31 整合酶基因 int 及整合位点 attP 的质粒 pSET152 为骨架，该质粒可在整合酶作用下高效定点整合至放线菌染色体同源的 attB 位点，接合转移效率较高，操作方便。为了克服 CRISPR-cBEST 碱基编辑器（CRISPR 耦联胞嘧啶脱氨酶系统，cBE）在放线菌中接合转移效率低的瓶颈，本研究将其克隆至 pSET152 载体，并引入四环素（Tc）诱导系统调控编辑器蛋白表达，成功构建了可控表达的整合型基因编辑器，在天蓝色链霉菌M145中实现了高效的碱基编辑。本发明提供了一种基于 φC31 整合系统的放线菌高效基因编辑工具，为遗传操作困难的放线菌基因功能研究提供了有优选的基因编辑工具。
转化前景
放线菌（Actinomycetes）尤其是链霉菌是活性天然产物发现的重要宝贵资源，但是众多 放线菌的遗传操作依然较为困难，严重阻碍了活性天然产物生物合成关键功能基因的研究。碱基编辑技术是一种衍生于 CRISPR/Cas系统的新型基因组编辑方法，是一种无DNA双链断裂，无需DNA模板，就能够在靶位点直接、不可逆地将一个碱基对直接转化为另一个碱基对的高效编辑系统。现有CRISPR-cBEST碱基编辑器（耦联胞嘧啶脱氨酶的CRISPR胞嘧啶碱基编辑器，cBE）以放线菌中常用的pSG5质粒为骨架构建，在纵多放线菌宿主中存在接合转移效率低，很难获得结合子，尤其是在稀有放线菌中很难开展遗传操作。同时，组成型表达的cBEST碱基编辑元件中，碱基编辑元件cBE的表达不可控等，这些局限性很大程度上限制了该技术在微生物基因碱基编辑领域的精准性应用。然而，质粒pSET152含有φC31的整合酶编码基因int和整合位点attP，通过整合酶的介导，可以将质粒整合到放线菌染色体中同源的attB位点处。φC31整合酶属于丝氨酸重组酶家族的成员，φC31 整合酶作用于 attB 位点和 attP 位点可以形成attL和attR，具有良好的遗传稳定性。pSET152和其他基于φC31整合酶的载体在许多链霉菌和其他放线菌中具有实用性，这些质粒在许多链霉菌属中的接合转移效率达到了1.6×10-4至 1.4×10-2，在其他某些非链霉菌属中的接合转移效率也可以很高。四环素 （Tc）诱导系统已成功用于调节许多生物体中基因表达的工具。tetO-tetR之间的相互作用非常强，在没有Tc的情况下可达到了高水平抑制，使用诱导剂即可将基因控制在所需的表达水平。